分子量測定

分子量を求める手法として、GPC法（Gel Permeation Chromatography，ゲル浸透クロマトグラフィー）がよく知られているかと思います。現在ではSEC法（Size Exclusion Chromatography，サイズ排除クロマトグラフィー）としても知られています。これらの手法は、カラムに詰めた充填剤の細孔サイズによって、サンプルの溶出の時間が変わることを利用し分子量を求める手法です。標準サンプルの溶出時間と比較して、サンプルの分子量を求める方法となるため得られる分子量は“相対分子量”となります。 一方で光散乱法による分子量の測定は、SLS法（Static Light Scattering, 静的光散乱法）という手法を用います。サンプルに光を照射した際、溶質分子から発せられた散乱光は、分子量の大きさに依存した強度が得られます。また、散乱光強度は溶質濃度と依存性があるので、異なる濃度から得られた散乱光強度を解析し、分子量を求める手法となります。GPCのように標準サンプルを必要としないため、得られる値は絶対分子量となります。

測定のイメージは、濃度に対して得られた散乱光の情報をプロットします。ここでは、ポリスチレン（F40）をトルエンに溶解させたときの測定結果を示します。

詳しい計算式などは、この先のコンテンツでご紹介をさせて頂く予定ですので、今回は省略をさせていただきますが、切片の逆数が分子量、傾きが第二ビリアル係数を表す直線を得ることができます。

２つの手法に関しての長所と短所をまとめたものが表1-1となります。

SLSの長所は、カラムを使った測定ではないため溶媒に制限がないのが特徴です。GPC法（SEC法）ではカラムとの相互作用を起こすような試料の測定は難しいですが、SLS法の場合は、サンプル溶液をガラスセルに入れて測定を行うため、相互作用を考える必要がありません。また、絶対分子量だけではなく、溶媒との親和性を示す第2ビリアル係数や高分子鎖の広がりを示す回転半径も求めることができる手法となっています。
光散乱測定の注意点としては、散乱光強度は粒子径の6乗に比例し大きくなりますので、測定サンプル中に含まれる不純物は光学精製を行い除去する必要があります。これらのテクニックについても、次回以降にご紹介させていただく予定です。

今回から、リレー形式で光散乱技術を用いた分子量測定に関するコラムを随時更新していきたいと思っています。SLS測定の方法やノウハウ、解析に関することまで幅広く取り扱っていく予定です。みなさまの研究や、学習に少しでもお役に立てれば幸いです。 ぜひとも、次のコラムもお楽しみに。

今回は、静的光散乱法（SLS法）による分子量測定の原理をご紹介します。

粒子および分子に電磁波（光）が当たると、粒子及び分子の電子がエネルギーを吸収し、振動を始めます。振動している電子からは電磁波（光）があらゆる方向に放出され散乱現象となります。

この放射電磁波（散乱光）の強度を、濃度や角度を変えながら測定し解析することで、溶液中の分子の分子量を測定します。

なお、この章は数式が多く出てきますので、「数式は苦手だな…」という方は、3.SLSの測定方法にお進み下さい！

ここではまず、気体中の粒子による光散乱を考えます。
散乱強度（I_s）と入射光の強度（I_o）の比は、入射光は垂直偏向のレーザーを使用する場合には、次式で与えられます。

　　N：分子の数
　　λ_o：入射光の波長
　　r：物質から検出器までの距離
　　α：分子の分極率

この、散乱強度が入射光の波長λの４乗に反比例する式を、Rayleighのλ^-4則と呼びます。
なお、分極率αは次式で表されます。

　　dn/dc：屈折率の濃度増分
　　M：分子量
　　NA：アボガドロ数

これらの式より、散乱光の強度から分子量を求めることが出来ます。

溶液中では分子と溶媒の熱力学的相互作用を考慮する必要があり、式は次のようになります。

また、 R(θ)=I_s r² I_o をレーリー比と呼び、光学定数 K=(4π²n²/λ_o⁴N_A)(dn/dc)²と置くことにより、次式のように表すことが一般的です。

粒子が波長以上の大きさになると粒子のあらゆる部分から散乱が干渉し合って散乱強度に角度依存性が現れます。これをP(θ)関数として表すと、式は次のようになります。

分子量が大きくなったり、溶液中で分子が広がっていると、同一分子上の複数の点からの散乱光が干渉を起こし、角度依存性が出てきます。ガウス鎖でかつ分布がある場合、慣性自乗半径のＺ平均値<S²>から得られる慣性半径（radius of gyration）<S²>^1/2および重量平均の絶対分子量Mwにより近似的に散乱強度を表し、散乱ベクトル q=(4πn/λ_o)sin(θ/2) を使って、実際に使いやすいプロットの形にしています。

横軸にKc/R(θ)、横軸にsin(θ/2)+Bcでプロットしたのが、Zimmプロットです。（Bは任意の定数）この式に基づいて、Kc/R(θ)をsin²(θ/2)+Bcに対してプロットすると、c→0，θ→0への外挿より分子量Mを、各濃度のθ→0の点を結ぶ線の初期勾配より第二ビリアル係数A₂を、各測定角度のc→0の点を結ぶ線の初期勾配より慣性半径<S²>^1/2が求められます。標準ポリスチレン（TOSO製F-40）のベンゼン溶液の例を示します。

静的光散乱法では、ある波長の光（レーザー光）を試料に入射させ、分子から散乱した光の強さを散乱角度（測定角度）の関数として測定します。装置の光学図を図3-1に示します。測定試料を円筒型の石英セルに入れ、図中の恒温槽内にセットします。恒温槽にはセルと屈折率の近い溶液（シリコンオイルなど）が入っています。光源（レーザー光）より照射された光がセルに入射し、試料から二次的な散乱光が四方八方に照射されます。この散乱光の強度を入射光に対してθの角度（散乱角度）を向いた受光部で測定します。受光部を回転させ、θを変えることで散乱光強度の散乱角度依存性を測定します。光源は、633nmや488nmなど単色光が用いられます。また、散乱光強度の測定には、アバランシェ・フォトダイオード、光電子倍増管が用いられます。通常の測定では、入射光は垂直偏光、検出器側には偏光素子は使いません（これをVv散乱という）。検出器前には、ピンホールを配置することで、セル中心部分からの散乱光のみを検出するように設計されています。

静的光散乱法に用いるレイリー比（測定条件に依らない試料固有の量）は、測定装置で直接測定することができません。レイリー比を計算するには、レイリー比が既知の標準物質（ベンゼンやトルエン；表3-1参照）について、散乱角度90°での散乱光強度を測定（キャリブレーション測定）し、換算の係数を求めます。サンプルから得られる散乱光強度は、溶質と溶媒から散乱される光の強度の和となっています。ほしい情報は溶質からの散乱光なので、サンプルと溶媒の散乱光強度をそれぞれ測定し、サンプルの散乱光強度から溶媒のそれを引いた過剰レイリー比(ΔRθ)を求めます。それに標準物質で求めた換算の係数をかけることで絶対値を求めます。

表3-1.　標準物質のレイリー比
（25℃、Vv条件、単位：cm-1）

分子量の解析手法はいくつかありますが、異なる散乱角度、サンプル濃度からそれぞれΔRθを求めます。解析手法については後述をご覧ください。
分子量を計算するパラメータの一つに示差屈折率増分(dn/dc)（屈折率の濃度増分）があり、静的光散乱装置とは別に示差屈折計で測定します。
光散乱測定は、他の多くの分光法と比較して、無色の低分子不純物が測定結果に及ぼす影響が小さい反面、散乱光の強い、例えば埃など大きな粒子からの散乱は大きな誤差を生じる原因となります。これらを取り除くため、測定溶液を適切なポアサイズの膜でろ過したり、遠心分離によって不純物粒子を沈降させた後、清浄な上澄み部分を測定セルに移す等の光学精製が必要となります。次回は精度の良いデータを得るための測定のノウハウについてご紹介します。

表3-2.　光散乱測定の流れ

静的光散乱法は、光（レーザー光）を測定試料に入射させ、そのサンプルから散乱した光の強度（散乱光強度）を検出器で測定します。そのため、サンプル以外の散乱光が検出器に届くと間違ったデータを得ることになり、せっかく測定したデータが使えないといったことになりかねません。今回は、そうならないためのノウハウについてご紹介します。

１．測定前の注意点

２．サンプル調製の注意点

表4-1.　標準資料ポリスチレン（溶媒：ベンゼン）溶液をろ過するのに用いた
シリンジフィルターの種類

３．測定条件の注意点

４．測定時のトラブル

• 分子量解析時、R(θ)の値がマイナスになる

サンプルのフィルターろ過時に溶質がフィルターに捕捉され、サンプルの散乱光強度より溶媒のそれの方が強くなる場合に起きます。対策としては、ろ過フィルターのポアサイズを再考慮します。

• 試料濃度を濃くしても散乱光強度が強くならない

未溶解物やミクロゲルがある場合、サンプルのフィルターろ過時に捕捉される可能性があります。従って、ろ過フィルターのポアサイズを再考慮します。または、溶解しやすい溶媒に変えて測定することも一つの方法です。

• 測定中の散乱光強度の変動が大きい

溶質が溶媒によく溶解していない場合や未溶解物やミクロゲル等がある場合、散乱光の変動が大きくなります。対策としては、ろ過フィルターのポアサイズを再考慮します。または、溶解しやすい溶媒に変えて測定します。

静的光散乱法では、分子量の大小や形状に適した各種のプロットが用いられています。表5-1にプロットの種類とその適応例および特長を示します。

注）Berryプロットでは角度、濃度各々別々にプロットを行う

代表的なZimmプロットを用いて分子量の解析例を以下に紹介します。
Zimmプロットの基本式は次式になります。

ここで、
　　R(θ)：レーリー比（還元散乱強度）、ｃ：濃度、
　　K：光学定数（=4π²ｎ²(dn/dc)²/（N_Aλ₀⁴）：直線偏光入射の場合）、
　　NA:アボガドロ数、λ₀：真空中での入射光波長、ｎ：媒体の屈折率、
　　dn/dc：屈折率の濃度増分、P(θ)：内部干渉因子
Y軸にKc/R(θ)、縦軸に濃度あるいは角度(sin²(θ/2))をプロットし、c->０、θ->０外挿時の傾きから、回転半径、第二ビリアル係数、切片より重量平均分子量Mwが求まります。 それぞれの求め方を次に示します。

　複数の濃度について得られているR(θ)の値を濃度ゼロ外挿し、このR(θ)c->0の角度依存性P(θ)を考えます。

ここでP(θ)は、と表されるので

の近似を使い、を代入しますと

​故に、を に対してプロットした傾きから（回転半径：）が、切片から重量平均分子量 Mw が求まります。

各濃度のR(θ)を角度０外挿しますと、P(θ)=1となるので、

となります。
これより、の濃度ｃに対するプロットの傾きから、１次近似の場合は第２ビリアル係数（A₂）が、2次近似では、第２ビリアル係数、第３ビリアル係数（A₃）が求まります。また、切片より重量平均分子量Mwが求まります。

それぞれの解析を一つの図にまとめたものがZimmプロットと呼ばれています。
下図に標準ポリスチレン（東ソー製F-40：溶媒ベンゼン）の測定例を示します。